Fitasi

Applicazione e principio della fitasi

Questa procedura viene utilizzata per determinare l'attività degli enzimi che rilasciano fosfato dal fitato. Il test si basa sull'idrolisi enzimatica del fitato di sodio in condizioni controllate misurando la quantità di orto fosfato rilasciato.

Reagenti e soluzioni 
[Nota: tutta la vetreria deve essere lavata con acido, risciacquata e pulita scrupolosamente per garantire l'assenza di fosfato.]
Tampone acetato (pH 5,5) Sciogliere 1,76 g di acido acetico al 100% (C2H4O2), 30,02 g di acetato di sodio triidrato (C2H3O2Na · 3H2O) e 0,147 g di cloruro di calcio diidrato in circa 900 mL di acqua. Trasferire la soluzione in un matraccio volumetrico da 1000 mL, diluire a volume con acqua e mescolare. Il pH dovrebbe essere 5,50 ± 0,05.
Soluzione substrato Sciogliere 8,40 g di sodio fitato decaidrato (C6H6O24P6Na12 · 10H2O) (Sigma Chemical Co.) in 900 mL di tampone acetato. Regolare il pH a 5,50 ± 0,05 a 37,0 ° ± 0,1 ° aggiungendo acido acetico 4 M. Raffreddare a temperatura ambiente. Trasferire quantitativamente la miscela in un matraccio tarato da 1000 mL, diluire a volume con Acetate Buffer e miscelare. Preparalo fresco ogni giorno.
Soluzione di acido nitrico (27%) Agitando, aggiungere lentamente 70 mL di acido nitrico al 65% a 130 mL di acqua.
Soluzione di eptamolibdato di ammonio Sciogliere 100 g di eptamolibdato di ammonio tetraidrato [(NH4) 6Mo7O24 · 4H2O] in 900 mL di acqua in un pallone volumetrico da 1000 mL. Aggiungere 10 mL di soluzione di ammoniaca al 25%, diluire a volume con acqua e mescolare. Questa soluzione è stabile per 4 settimane se conservata a temperatura ambiente e al riparo dalla luce.
Soluzione di vanadato di ammonio Sciogliere 2,35 g di monovanadato di ammonio (NH4VO3) in 400 mL di acqua calda (60 °). Mentre si agita, aggiungere lentamente 20 mL di soluzione di acido nitrico (27%). Raffreddare a temperatura ambiente. Trasferire quantitativamente la miscela in un matraccio volumetrico da 1000 mL, diluire a volume con acqua e mescolare. Questa soluzione è stabile per 4 settimane se conservata a temperatura ambiente e al riparo dalla luce.
Soluzione colorante / bloccante Agitando, aggiungere 250 mL di soluzione di vanadato di ammonio a 250 mL di soluzione di eptamolibdato di ammonio. Aggiungere lentamente 165 mL di acido nitrico al 65%. Raffreddare a temperatura ambiente. Trasferire quantitativamente la miscela in un matraccio volumetrico da 1000 mL, diluire a volume con acqua e mescolare. Preparalo fresco ogni giorno.
Soluzione di potassio diidrogeno fosfato Essiccare una quantità sufficiente di potassio diidrogeno fosfato (KH2PO4) in una stufa sotto vuoto a una temperatura compresa tra 100 ° e 104 ° per 2 ore. Raffreddare a temperatura ambiente in un essiccatore su gel di silice essiccato.
In duplicato (soluzioni A e B), pesare circa 0,245 g di potassio diidrogeno fosfato essiccato con precisione fino a 1 mg e diluire con Tampone acetato a 1 L per ottenere soluzioni contenenti 1,80 mmol / L di potassio diidrogeno fosfato.
Phytase Reference Preparation (preparazione di fitasi altamente concentrata) Questa preparazione può essere ottenuta da Gist-Brocades, Delft, Paesi Bassi, con un'attività assegnata (mediante saggio collaborativo), oppure l'attività della preparazione di riferimento può essere determinata secondo la Procedura 2.
Soluzioni di riferimento per fitasi, procedura 1 Pesare una quantità di preparazione di riferimento per fitasi corrispondente a 20.000 unità di fitasi con precisione entro 1 mg in duplicato in matracci tarati da 200 mL. Sciogliere e diluire a volume con Acetate Buffer e mescolare. Diluire con acetato tampone per ottenere diluizioni contenenti circa 0,01, 0,02, 0,04, 0,06 e 0,08 unità di fitasi per 2,0 mL della diluizione finale.
Preparazione del campione, procedura 1 Sospendere o sciogliere e diluire quantità accuratamente pesate di campione in tampone acetato in modo che 2,0 mL della diluizione finale contengano tra 0,02 e 0,08 unità di fitasi.

Preparazione del campione, procedura 2 In duplicato, pesare accuratamente le quantità di Phytase Reference Preparation e sciogliere e diluire in Acetate Buffer per ottenere diluizioni contenenti 0,06 ± 0,006 unità di fitasi per 2,0 mL della diluizione finale.

Procedure
Procedura 1 (Determinazione dell'attività fitasica) Trasferire 2,00 mL della preparazione del campione, Procedura 1, e le soluzioni di riferimento per fitasi, Procedura 1, in provette di vetro separate da 20 × 150 mm. Utilizzando un cronometro e iniziando a tempo uguale a zero, nell'ordine della serie e entro intervalli di tempo regolari, posizionare le provette in un bagnomaria a 37,0 ° ± 0,1 ° e lasciare che il loro contenuto si stabilizzi per 5 min. Al tempo uguale a 5 min, nello stesso ordine della serie e con gli stessi intervalli di tempo, aggiungere 4,0 mL di Soluzione Substrato (precedentemente equilibrata a 37,00 ± 0,10) a ciascuna provetta. Mescolare e sostituire a bagnomaria a 37,0 ° ± 0,1 °. Al tempo è uguale a 65 min, nello stesso ordine e negli stessi intervalli di tempo, terminare l'incubazione aggiungendo 4,0 mL di soluzione colorante / bloccante. Mescolare e raffreddare a temperatura ambiente.
Preparare gli spazi vuoti trasferendo 2,00 mL della preparazione del campione, procedura 1, e delle soluzioni di riferimento fitasi, procedura 1, in provette di vetro separate da 20 × 150 mm. Utilizzando un cronometro e iniziando a tempo uguale a zero, nell'ordine della serie e entro intervalli di tempo regolari, posizionare le provette in un bagnomaria a 37,0 ° ± 0,1 ° e lasciarle equilibrare per 5 min. A un tempo uguale a 5 min, nello stesso ordine della serie e negli stessi intervalli di tempo, aggiungere 4,0 mL di soluzione colorante / bloccante. Mescolare e raffreddare a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 4,00 mL di soluzione substrato alle provette vuote e miscelare.
Centrifugare tutte le provette per 5 min a 3000 × g. Determinare l'assorbanza di ciascuna soluzione a 415 nm in una cella con un percorso di 1 cm con uno spettrofotometro adatto, utilizzando acqua per azzerare lo strumento.
Procedura 2 (Determinazione dell'attività fitasi della preparazione di riferimento fitasi) Trasferire 2,00 mL di preparazione del campione, Procedura 2 e 2,00 mL (tre volte dalla soluzione di potassio diidrogeno fosfato A e due volte da B) di soluzioni di potassio diidrogeno fosfato in 20 separate - provette in vetro da 150 mm. Utilizzando un cronometro e iniziando a tempo uguale a zero, nell'ordine della serie e entro intervalli di tempo regolari, posizionare le provette in un bagnomaria a 37,0 ° ± 0,1 ° e lasciare che il loro contenuto si stabilizzi per 5 min. Al tempo uguale a 5 min, nello stesso ordine della serie e negli stessi intervalli di tempo, aggiungere 4,0 mL di Soluzione Substrato (precedentemente equilibrata a 37,0 ° ± 0,1 °) alle provette. Mescolare e sostituire a bagnomaria a 37,0 ° ± 0,1 °. A un tempo uguale a 35 min, nello stesso ordine e negli stessi intervalli di tempo, terminare l'incubazione aggiungendo 4,0 mL di soluzione colorante / bloccante. Mescolare e raffreddare a temperatura ambiente.

Preparare gli spazi vuoti trasferendo 2,00 mL di preparazione del campione, procedura 2, in provette di vetro separate da 20 × 150 mm. Preparare i bianchi reagenti trasferendo 2,00 mL di acqua in una serie di cinque provette di vetro separate da 20 × 150 mm. Aggiungere 4,0 mL di soluzione colorante / bloccante a tutte le provette vuote e mescolare. Quindi aggiungere 4,0 mL di soluzione per substrato e mescolare. Determinare l'assorbanza di ciascuna soluzione a 415 nm in una cella con un percorso di 1 cm con uno spettrofotometro adatto, utilizzando acqua per azzerare lo strumento.

Calcoli
Calcolo, procedura 1 Una unità di fitasi (fitasi) (FTU) è la quantità di enzima che libera fosfato inorganico a 1 µmol / min da fitato di sodio 0,0051 mol / L a 37,00 a pH 5,50 nelle condizioni del test. Calcolare l'assorbanza corretta (campione meno bianco) per ciascuna preparazione del campione e soluzione di riferimento fitasi. Riportare in un grafico l'attività fitasi (FTU per 2 mL) accuratamente calcolata di ciascuna soluzione di riferimento fitasi rispetto all'assorbanza corrispondente. Dalla curva, determinare l'attività fitasi in ciascuna preparazione del campione (FTU per 2 mL):

Attività (FTU / g) = (FTU per 2 mL × diluizione) / peso del campione (g).


Calcolo, procedura 2 Calcolare le assorbanze corrette AR per ciascuna preparazione del campione (assorbanza Phytase Reference Solution meno il corrispondente bianco di assorbanza) e per ciascuna soluzione di potassio diidrogeno fosfato, Ap (assorbanza di potassio diidrogeno fosfato soluzione meno assorbanza media del reagente bianco). Calcola C, la concentrazione di fosfato di ciascuna soluzione di potassio diidrogeno fosfato:

(W × 1000 × 2) / MW = C (mmol / 2 mL).

Calcolare le assorbanze D per ciascuna soluzione di potassio diidrogeno fosfato dopo la correzione per la quantità di potassio diidrogeno fosfato pesata:

Ap / C = D (unità di assorbanza / mmol di fosfato per 2 mL).

Calcola la media dei risultati D, ottenendo E (differenza massima consentita, 5%).
Calcola l'attività per ciascuna preparazione di riferimento fitasi:

(AR × f) / (30 × R × E) = FTU / g,

in cui AR è uguale all'assorbanza corretta della soluzione standard di fitasi; f è uguale al fattore di diluizione totale del preparato di riferimento; 30 è uguale al tempo di incubazione, in min; R è uguale al peso del campione, in g; E è uguale alla media dei fattori D; W è uguale al peso del potassio diidrogeno fosfato, in g; e MW è uguale al peso molecolare del diidrogeno fosfato di potassio, 136,09 (g / mol).

CERTIFICATO DI ANALISI

Confezionamento e conservazione

Busta da imballaggio per alimenti solidi, 25 kg / barile.

Phytase deve essere conservato in luoghi asciutti, freschi e ben ventilati, lontano dal sole, dal calore.

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