Peptidasi

b. Take 1.00mL of each of the above personnel (parallel test is required), add 5.00mL of 0.4mol / L sodium carbonate solution, 1.00mL of Folin reagent use solution, place in a 40 ± 0.2 ℃ water bath for 20min, and take it out. Use a spectrophotometer at a wavelength of 680nm and 10mm cuvette. Take the "0" tube containing no tyrosine as blanks, and measure the absorbance respectively. Take the absorbance A as the ordinate and the tyrosine concentration c as the abscissa. , Draw a standard curve (this curve should pass the zero point).

According to the plot or the regression equation, the amount of tyrosine (ug) when the absorbance is 1 is calculated, which is the absorbance constant K value. Its K value should be in the range of 95-100.

2 Determination
(1) Preparation of Peptidase
a. Weigh 1~2g of enzyme powder, accurate to 0.0002g (or absorb 1.00mL of liquid enzyme), dissolve with a small amount of pH6.0 buffer solution, and grind it with a glass rod, then carefully pour the supernatant into a volumetric flask. Add a small amount of the above-mentioned buffer solution to the sediment to dissolve it, and grind it for 3 to 4 times, and finally transfer it all into a volumetric flask, make up to volume with the buffer solution, and shake well. Filter through four layers of gauze, and the filtrate is once again diluted to the appropriate concentration with a buffer according to the enzyme activity for measurement (diluted to the measured absorbance within the range of 0.25 to 0.40).
b. For the determination of enzyme powder, refer to Table A4 for the dilution factor (liquid enzyme can also refer to Table A4 for dilution).

(2) Measurement

a. First put the casein solution into a 40 ± 0.2 ℃ constant temperature water bath and preheat for 5min.
b. Follow the procedure below:
Test tube A (blank)
→ Add 1.00mL of enzyme solution (40 ± 0.2 ℃)
→ Add 2.00mL of trichloroacetic acid (shake well) (40 ± 0.2 ℃)
→ Add casein 1.00mL (shake well)
→ Take it out for 10 minutes and filter
→ take 1.00mL filtrate
→ Add sodium carbonate solution 5.00mL
→ 1.00 mL of Jiafulin reagent solution (40 ± 0.2 ℃, color development 20min)
→ At a wavelength of 680nm, measure its absorbance with a 10mm cuvette

Test tube B (enzyme sample, three parallel samples are required)
→ Add 1.00mL of enzyme solution (40 ± 0.2 ℃)
→ Add casein 1.00mL (shake well, react at 40 ± 0.2 ℃ for 10min)
→ Add 2.00mL of trichloroacetic acid (shake well)
→ Take it out for 10 minutes and filter
→ take 1.00mL filtrate
→ Add sodium carbonate solution 5.00mL
→ 1.00 mL of Jiafulin reagent solution (40 ± 0.2 ℃, color development 20min)
→ At a wavelength of 680nm, measure its absorbance with a 10mm cuvette

Calculation
X = A × K × 4/10 × n = 2/5 × A × K × n
In the formula:
X ---- enzyme activity of the sample, u / g (u / mL);
A ---- The average absorbance of the sample in parallel test;
K ---- absorption constant;
4 ---- the total volume of the reaction;
10 --- reaction time 10min, calculated as 1min;
n ---- Dilution multiple.

The result obtained is expressed as an integer.

The allowable difference between the results of parallel tests shall not exceed 3%.

CERTIFICATE OF ANALYSIS 

Definizione di peptidasi

1 g di polvere enzimatica (o 1 ml di enzima liquido), a 40, pH 6,0, 1 min idrolizza la caseina per produrre 1 ug di tirosina come unità di attività enzimatica in u / g (u / ml).

Metodo del fiorino

Principio diPeptidasi
Peptidasi hydrolyzes casein substrates at 40 ° C and pH 6.0 to produce amino acids containing phenolic groups. Under alkaline conditions, Folin reagent is reduced to form molybdenum blue and tungsten blue. Measure with spectrophotometer and calculate. Its enzyme activity.

Reagenti e soluzioni
1 Preparation of Peptidasi
In un dispositivo di riflusso con bocca del mulino da 2000 mL, aggiungere 100 g di tungstato di sodio (Na2WO4 · 2H2O), 25 g di molibdato di sodio (Na2MOO4 · 2H2O), 700 mL di acqua, 50 mL di acido fosforico all'85%, 100 mL di concentrato acido cloridrico, far bollire a fuoco basso per 10 ore, rimuovere il refrigeratore a ricadere In una cappa aspirante, aggiungere 50 g di solfato di litio (LiSO4), 50 mL di acqua e alcune gocce di acqua di bromo concentrato (99%) e far bollire per 15 minuti per rimuovere il bromo in eccesso (aggiungere l'acqua di bromo verde dopo il raffreddamento e far bollire leggermente Rimuovere il bromo in eccesso), raffreddare, aggiungere l'acqua a volume a 1000 mL, mescolare bene e filtrare. I reagenti devono essere di colore giallo dorato e conservati in flaconi marroni.
Soluzione d'uso: mescolare una parte di reagente Fulin con due parti di acqua e agitare bene.
2 Soluzione di carbonato di sodio c (Na2CO3) = 0.4mol / L
Prendere 42,4 g di carbonato di sodio anidro, sciogliere in acqua e portare a 1000 ml.
3 Acido tricloroacetico c (CCL3 · COOH) = 0,4mol / L
Prendere 65,4 g di acido tricloroacetico, sciogliere in acqua e portare a 1000 ml.
4 Soluzione di idrossido di sodio c = 0,5mol / L
Preparato secondo GB 601.
5 Soluzione di acido cloridrico c = 1mol / L e 0,1mil / L
GB 601: Misurare 90 mL di acido cloridrico, versare in 1000 mL di acqua e agitare per ottenere 1mol / L di acido cloridrico.
Misurare 9 ml di acido cloridrico, versarlo in 1000 ml di acqua e agitare per ottenere 0,1 ml / L di acido cloridrico.
6 Soluzione tampone
Tampone fosfato (pH = 6,0) per proteasi aromatiche
Pesare 45,23 g di fosfato bisodico (Na2HPO4 · 12H2O) e 8,07 g di acido citrico (C6H6O7 · H2O), sciogliere in acqua e portare a 1000 mL. Dopo la preparazione, utilizzare un pHmetro per correggerla.
7 Soluzione di caseina (caseina) 10 g / L
Pesare 1.000 g di caseina, con una precisione di 0,001 g, bagnare con una piccola quantità di soluzione di idrossido di sodio 0,5 mol / L, aggiungere circa 80 ml di tampone a pH 6,0 e mescolare riscaldando a bagnomaria bollente fino a completa dissoluzione. , Trasferire in un matraccio volumetrico da 100 mL e diluire fino alla tacca con tampone pH 6.0. Questa soluzione viene conservata in frigorifero per un periodo di 3 giorni.
8 Soluzione standard 100ug / mLL-tirosina
un. Pesare 0,1000 g di L-tirosina essiccata a peso costante a 105 ° C, con una precisione di 0,0002 g, e sciogliere con 60 mL di acido cloridrico 1 mol / L per ottenere fino a 100 mL.
b. Pipettare 10,00 mL di una soluzione standard di tirosina 1 mg / mL e portare a 100 mL con acido cloridrico 0,1 mol / L per ottenere una soluzione standard di tirosina 100 ug / mLL.

Instruments and equipment Of Peptidasi
1 bagnomaria a temperatura costante: 40 ± 0,2 â „ƒ
2 Spettrofotometro: deve soddisfare i requisiti di GB 9721

Analysis steps Of Peptidasi
1 Disegno della curva standard
un. Soluzione standard di L-tirosina Preparata secondo la Tabella A3

Tabella A3

Confezionamento e conservazione

Busta da imballaggio per alimenti solidi, 25 kg / barile.

Peptidasi should be sconservato in luoghi asciutti, freschi e ben ventilati, lontano dal sole, dal calore.

Pagamento:T / T, Paypal, Western Union, Alibaba Trade Assurance, VISA, MasterCard, e-Checking, Pay Later, LC e così via.