Nattokinase

PRINCIPIO

La nattochinasi agisce sulla fibrina, rompendo il legame peptidico e forma prodotti solubili in acido a basso peso molecolare, misurati mediante spettrofotometro.

Una unità di attività fibrinolitica (FU) è definita come la quantità dell'enzima, che aumenta l'assorbanza del filtrato a 275 nm di 0,01 al minuto nelle condizioni specificate nella procedura.

REAGENTI Di Nattokinase
Tampone borato 1.0.05M (pH 8.5) - Sciogliere 9,54 g di borato di sodio (Na2B4O710H2O) e 4,5 g di cloruro di sodio (NaCl) in circa 200 ml di acqua deionizzata. Regolare il pH a 8,5 con HCl 1N e aggiungere acqua deionizzata per ottenere 500 ml.
2.0.2N TCA - Sciogliere 8,17 g di acido tricloroacetico (CCl3CO2H) in acqua deionizzata per ottenere 250 ml.
3. Soluzione di trombina - Utilizzando una siringa, iniettare 5,0 ml di tampone borato 0,05 M in un flacone di trombina (Sigma, T-6634). Mescola delicatamente per sciogliere completamente. Con la siringa, trasferire aliquote da 1 ml in flaconcini di plastica (100 unità / flaconcino) e congelarli per la conservazione.
* Al momento dell'uso diluire il contenuto di una fiala a 4 ml di tampone borato 0,05 M e miscelare con il puntale del pipettatore (utilizzare lo stesso puntale quando si esegue il test) per ottenere una concentrazione finale di 20 U / ml. Assicurati che sia completamente sciolto.

4. Soluzione di acetato (pH 6.0) - Sciogliere 12,96 g di acetato di sodio anidro (CH3CO2Na) in acqua deionizzata, aggiungere 2,38 ml di soluzione di acido acetico 2N e diluire a 100 ml con acqua deionizzata.

10% Triton X-100 - Sciogliere 5,0 g di Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol) in acqua deionizzata con riscaldamento e aggiungere acqua deionizzata per ottenere 50 ml. Conservare in una bottiglia marrone.

5.Diluente enzimatico: sciogliere 0,344 g di solfato di calcio, diidrato (CaSO42H2O) e 0,585 g di cloruro di sodio (NaCl) in acqua deionizzata, aggiungere 2,0 ml di soluzione di acetato e 0,5 ml di soluzione di tritone al 10% e acqua deionizzata per preparare 1 litro.

6. Substrato fibrinogeno - Aggiungere 10,0 ml di tampone borato 0,05 M a 96,0 mg di fibrinogeno (Sigma, Fraction I tipo I-S, F8630) a poco a poco mescolando delicatamente e sciogliere completamente in un becher da 50 ml. Preparare fresco ogni giorno (* 1)

                                                                 

PREPARAZIONE DELLA SOLUZIONE CAMPIONE
Diluire il campione con il diluente enzimatico per ottenere un'assorbanza corretta (∠† A) del filtrato tra 0,04 e 0,08 la concentrazione è normalmente compresa tra 0,67 e 1,33 FU / ml

PROCEDURA CAMPIONE Di Nattokinase

1. Pipettare 1,4 ml di tampone borato e 0,4 ml di soluzione substrato di fibrinogeno in una provetta da centrifuga adatta, agitare su vortex e incubare a bagnomaria a 37 ° C per 5 minuti.
2. Aggiungere esattamente 0,1 ml di soluzione di trombina e miscelare adeguatamente sul vortice.
3.Dopo 10 minuti esatti, aggiungere 0,1 ml di soluzione campione di enzimi, mescolare per 5 secondi e incubare a 37 ° C.
4. Dopo 20 e 40 minuti dall'inizio della reazione, mescolare rispettivamente per 5 secondi.
5.Dopo 60 minuti esatti, aggiungere 2 ml di soluzione TCA per arrestare la reazione, mescolare e incubare a 37 ° C per altri 20 minuti.
6. Centrifugare a 5.000 rpm per 15 minuti.

7. Pipettare con attenzione 1 ml di surnatante in una cuvetta al QUARZO con una pipetta Pasteur e leggere l'assorbanza (As) a 275 nm.

VUOTO
1. Pipettare 1,4 ml di tampone borato e 0,4 ml di soluzione di substrato di fibrinogeno in una provetta centrifugata e incubare a bagnomaria a 37 ° C per 5 minuti.
2. Aggiungere esattamente 0,1 ml di soluzione di trombina e agitare su vortex.
3.Dopo 10 minuti esatti, aggiungere 2 ml di soluzione TCA e mescolare per 5 secondi.
4. Aggiungere 0,1 ml di campione alla soluzione, mescolare per 5 secondi e incubare a 37 ° C per 20 minuti esatti.
5. Centrifugare a 5.000 rpm per 15 minuti.
6. Pipettare con attenzione 1 ml di surnatante in una cuvetta di QUARZO con una pipetta Pasteur e leggere l'assorbanza a (Ab) 275 nm. (* 2)

CALCOLO
(As - Ab) 1 1
FU / g = _____________ x ________ x _______ x D
0,01 60 0,1

D = Fattore di diluizione (1 / Peso (g / mL))

CERTIFICATO DI ANALISI

Confezionamento e conservazione

Busta da imballaggio per alimenti solidi, 25 kg / barile.

Nattokinase deve essere conservato in luoghi asciutti, freschi e ben ventilati, lontano dal sole, dal calore.

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