Catalase

Applicazione e principio

Questa procedura viene utilizzata per determinare l'attività della catalasi, espressa come unità Baker, di preparati derivati ​​da Aspergillus niger var, fegato bovino o Micrococcus lysodeikticus. Il saggio è un metodo di esaurimento basato sulla scomposizione del perossido di idrogeno da parte della catalasi e la scomposizione simultanea della catalasi da parte del perossido in condizioni controllate.

Reagenti e soluzioni
Soluzione di molibdato di ammonio (1%) Sciogliere 1,0 g di molibdato di ammonio [(NH4) 6MoO24 · 4H2O] (Merck, n. Di catalogo 1182) in acqua e diluire a 100 mL.
Tiosolfato di sodio 0,250 N Sciogliere 62,5 g di tiosolfato di sodio (Na2S2O3 · 5H2O) in 750 mL di acqua bollita e raffreddata di recente, aggiungere 3,0 mL di idrossido di sodio 0,2 N come stabilizzante, diluire a 1000 mL con acqua e mescolare. Standardizzare come indicato per 0,1 N di tiosolfato di sodio (vedere Soluzioni e indicatori) e, se necessario, regolare esattamente a 0,250 N.

Soluzione di substrato di perossido Sciogliere 25,0 g di fosfato di sodio bibasico anidro (Na2HPO4) o 70,8 g di Na2HPO4 · 12H2O, in circa 1500 mL di acqua e regolare a pH 7,0 ± 0,1 con acido fosforico all'85%. Aggiungere con cautela 100 mL di perossido di idrogeno al 30%, diluire a 2000 mL in una soluzione graduata e mescolare. Conservare in una bottiglia di colore ambra pulita, chiusa in modo lasco. La soluzione è stabile per più di 1 settimana se conservata a 5 ° in contenitore pieno. (Con il substrato appena preparato, il bianco richiederà circa 16 mL di tiosolfato di sodio 0,250 N. Se il bianco richiede meno di 14 mL, la soluzione del substrato non è adatta e deve essere preparata di nuovo fresca. La titolazione del campione deve essere compresa tra 50% e 80 % di quella richiesta per il bianco.)

Procedura
Pipettare un'aliquota non superiore a 1,0 mL del campione, precedentemente diluito per contenere circa 3,5 unità Baker di catalasi, in un becher da 200 mL. Aggiungere rapidamente 100 mL di soluzione substrato di perossido, precedentemente regolata a 25, e agitare immediatamente per 5-10 s. Coprire il becher e incubare a 25 ± 1 fino al completamento della reazione. Mescolare vigorosamente per 5 secondi, quindi pipettare 4,0 ml dal becher in una beuta da 50 ml. Aggiungere 5 mL di acido solforico 2 N al pallone, mescolare, quindi aggiungere 5,0 mL di soluzione di ioduro di potassio al 40%, appena preparata, e 1 goccia di soluzione di molibdato di ammonio (1%) e mescolare. Continuando a miscelare, titolare rapidamente fino a un punto finale incolore con tiosolfato di sodio 0,250 N, registrando il volume, in millilitri, richiesto come S. Eseguire una determinazione in bianco con 4,0 mL di soluzione substrato di perossido e registrare il volume richiesto, in millilitri, come B.

[Nota: quando vengono testati preparati derivati ​​dal fegato di manzo, la reazione è completa entro 30 min. I preparati derivati ​​da Aspergillus e altre fonti possono richiedere fino a 1 ora. Nel saggio di un enzima di origine sconosciuta, eseguire una titolazione dopo 30 minuti e successivamente a intervalli di 10 minuti. La reazione è completa quando due titolazioni consecutive sono uguali.]

Calcolo
Una Baker Unit è definita come la quantità di catalasi che decomporrà 264 mg di perossido di idrogeno nelle condizioni del test.
Calcola l'attività del campione con l'equazione
Unità Baker / go mL = 0,4 (B S) × (1 / C)

in cui C sono i millilitri di aliquota della preparazione enzimatica originale aggiunti a ogni 100 mL di soluzione substrato di perossido, o quando si usa 1 mL di enzima diluito, C è il fattore di diluizione; B è il volume, in millilitri, come definito sopra; e S è i millilitri di tiosolfato di sodio 0,250 N, come definito sopra.

CERTIFICATO DI ANALISI

Confezionamento e conservazione

Busta da imballaggio per alimenti solidi, 25 kg / barile.

La catalasi deve essere conservata in luoghi asciutti, freschi e ben ventilati, lontano dal sole, dal calore.

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