Proteasi alcalina
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Proteasi alcalina

La proteasi alcalina deve essere conservata in luoghi asciutti, freschi e ben ventilati, lontano dal sole, dal calore.

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Applicazione e principio

Questa proteasi alcalina viene utilizzata per determinare l'attività della proteasi, espressa come unità PC, di preparati derivati ​​da Bacillus subtilis var. e Bacillus licheniformis var. Il test si basa su un'idrolisi proteolitica di 30 minuti della caseina a 37 ° e pH 7,0. La caseina non idrolizzata viene rimossa per filtrazione e la caseina solubilizzata viene determinata spettrofotometricamente.


Reagenti e soluzioni di proteasi alcaline
Caseina Utilizzare caseina di grado Hammarsten (United States Biochemical Corp., n. Di catalogo 12840 o equivalente).
Tampone Tris (pH 7,0) Sciogliere 12,1 g di tris (idrossimetil) aminometano di grado enzimatico (o equivalente) in 800 mL di acqua e titolare con acido cloridrico 1 N a pH 7,0. Trasferire in un matraccio volumetrico da 1000 ml, diluire a volume con acqua e mescolare.
Soluzione TCA Sciogliere 18 g di acido tricloroacetico e 19 g di sodio acetato triidrato in 800 mL di acqua in un matraccio tarato da 1000 mL, aggiungere 20 mL di acido acetico glaciale, diluire a volume con acqua e mescolare.
Soluzione substrato Sciogliere 6,05 g di tris (idrossimetil) aminometano di grado enzimatico in 500 mL di acqua, aggiungere 8 mL di acido cloridrico 1 N e mescolare. Sciogliere 7 g di caseina in questa soluzione e riscaldare per 30 min a bagnomaria bollente, mescolando di tanto in tanto.
Raffreddare a temperatura ambiente e regolare a pH 7,0 con acido cloridrico 0,2 N, aggiungendo l'acido lentamente, con vigorosa agitazione, per evitare la precipitazione della caseina. Trasferire la miscela in un matraccio volumetrico da 1000 mL, diluire a volume con acqua e mescolare.

Preparazione del campione Utilizzando il tampone Tris, preparare una soluzione della preparazione enzimatica del campione in modo che 2 mL della diluizione finale contengano tra 10 e 44 unità di proteasi batteriche.


Procedura di proteasi alcalina
Pipettare 10,0 mL di Soluzione Substrato in ciascuna di una serie di provette da 25 × 150 mm, consentendo una provetta per ciascun test enzimatico, una provetta per ogni bianco enzimatico e una provetta per un bianco substrato. Equilibrare le provette per 15 min in un bagnomaria mantenuto a 37 ° ± 0,1 °.
Avviando il cronometro a tempo zero, pipettare rapidamente 2,0 mL della preparazione del campione nel substrato equilibrato. Mescolare e sostituire le provette a bagnomaria. Aggiungere 2 mL di tampone Tris (invece della preparazione del campione) al bianco del substrato. Dopo 30 minuti esatti, aggiungere 10 mL di soluzione TCA a ciascun enzima di incubazione e al bianco del substrato per arrestare la reazione. Riscaldare le provette a bagnomaria per altri 30 minuti per consentire alla proteina di coagularsi completamente.
Al termine del secondo periodo di riscaldamento, agitare vigorosamente ciascuna provetta e filtrare su carta da filtro Whatman n. 42 da 11 cm o equivalente, scartando i primi 3 mL di filtrato.
[Nota: il filtrato deve essere perfettamente limpido.]
Determinare l'assorbanza di ogni campione filtrato in una cella di 1 cm, a 275 nm, con uno spettrofotometro adatto, utilizzando il filtrato dal bianco del substrato per impostare lo strumento a zero. Correggere ciascuna lettura sottraendo la lettura del bianco enzimatico appropriato e registrare il valore così ottenuto come AU.

Trasferimento con curva standard 100,0 mg di L-tirosina, grado cromatografico o equivalente (Aldrich Chemical Co.), precedentemente essiccato a peso costante, in un matraccio volumetrico da 1000 mL. Sciogliere in 60 mL di acido cloridrico 0,1 N. Quando completamente sciolto, diluire la soluzione a volume con acqua e mescolare accuratamente. Questa soluzione contiene 100 µg di tirosina in 1,0 mL. Preparare altre tre diluizioni da questa soluzione madre per contenere 75,0, 50,0 e 25,0 µg di tirosina per mL. Determinare l'assorbanza delle quattro soluzioni a 275 nm in una cella di 1 cm su uno spettrofotometro adatto contro 0,006 N di acido cloridrico. Preparare un grafico di assorbanza rispetto alla concentrazione di tirosina.


Calcolo della proteasi alcalina
Una unità di proteasi batterica (PC) è definita come quella quantità di enzima che produce l'equivalente di 1,5 µg / mL di L-tirosina al minuto nelle condizioni del test.
Dalla curva standard, e per interpolazione, determinare l'assorbanza di una soluzione avente una concentrazione di tirosina di 60 µg / mL. Si dovrebbe ottenere una cifra prossima a 0,0115. Dividere il valore interpolato per 40 per ottenere l'assorbanza equivalente a quella di una soluzione con una concentrazione di tirosina di 1,5 µg / mL e registrare il valore così derivato come AS.
Calcola l'attività della preparazione enzimatica del campione mediante l'equazione

PC / g = (AU / AS) × (22 / 30W)

in cui 22 è il volume finale, in mL, della miscela di reazione; 30 è il tempo, in min, della reazione; e W è il peso, in g, del campione originale prelevato.

Confezionamento e conservazione della proteasi alcalina

Busta da imballaggio per alimenti solidi, 25 kg / barile.


La proteasi alcalina deve essere conservata in luoghi asciutti, freschi e ben ventilati, lontano dal sole, dal calore.

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