Proteasi acida
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Proteasi acida

Questa proteasi acida viene utilizzata per determinare l'attività proteolitica, espressa come unità di emoglobina su base tirosina (HUT).

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Applicazione e principio

Questa proteasi acida viene utilizzata per determinare l'attività proteolitica, espressa come unità di emoglobina su base tirosina (HUT), di preparati derivati ​​da Aspergillus oryzae var e Aspergillus niger var, e può essere utilizzata per determinare l'attività di altre proteasi a pH 4.7 . Il test si basa sull'idrolisi enzimatica di 30 minuti di un substrato di emoglobina a pH 4,7 e 40 °. Il substrato non idrolizzato viene precipitato con acido tricloroacetico e rimosso mediante filtrazione. La quantità di emoglobina solubilizzata nel filtrato viene determinata spettrofotometricamente.


Reagenti e soluzioni di proteasi acide
Emoglobina Usare il substrato di emoglobina in polvere (Sigma Chemical Co., n. Di catalogo H2625) o un materiale simile di alta qualità completamente solubile in acqua.
Soluzione tampone acetato Sciogliere 136 g di acetato di sodio (NaC2H3O2 · 3H2O) in acqua sufficiente per ottenere 500 mL. Mescolare 25,0 mL di questa soluzione con 50,0 mL di acido acetico 1 M, diluire a 1000 mL con acqua e mescolare. Il pH di questa soluzione dovrebbe essere 4,7 ± 0,02.
Soluzione substrato Trasferire 4,0 g di emoglobina in un becher da 250 mL, aggiungere 100 mL di acqua e agitare per 10 minuti per sciogliere. Immergere gli elettrodi di un pHmetro nella soluzione e, mescolando continuamente, regolare il pH a 1,7 aggiungendo 0,3 N di acido cloridrico. Dopo 10 min, regolare il pH a 4,7 aggiungendo 0,5 M di acetato di sodio. Trasferire la soluzione in un matraccio volumetrico da 200 mL, diluire a volume con acqua e mescolare. Questa soluzione è stabile per circa 5 giorni se refrigerata.
Soluzione di acido tricloroacetico Sciogliere 140 g di acido tricloroacetico in circa 750 mL di acqua. Trasferire la soluzione in un matraccio volumetrico da 1000 mL, diluire a volume con acqua e mescolare accuratamente.

Preparazione del campione Sciogliere una quantità di campione nella soluzione tampone acetato per produrre una soluzione contenente, in ogni mL, tra 9 e 22 HUT. (Una tale concentrazione produrrà una lettura di assorbanza, nella procedura seguente, nell'intervallo preferito da 0,2 a 0,5.)


Procedura di proteasi acida
Pipettare 10,0 mL di Soluzione Substrato in ciascuna di una serie di provette da 25 × 150 mm: una per ciascun test enzimatico e una per il bianco del substrato. Riscaldare le provette a bagnomaria a 40 ° per circa 5 min. A ciascuna provetta, ad eccezione del bianco del substrato, aggiungere 2,0 mL di preparazione del campione e iniziare a cronometrare la reazione nel momento in cui viene aggiunta la soluzione; aggiungere 2,0 mL di soluzione tampone acetato alla provetta del substrato. Chiudere le provette con i tappi di gomma n. 4 e picchiettare delicatamente ciascuna provetta per 30 secondi contro il palmo della mano per miscelare. Riscaldare ciascuna provetta a bagnomaria a 40 ° C per 30 min esatti, quindi pipettare rapidamente 10,0 mL di soluzione di acido tricloroacetico in ciascuna provetta. Agitare vigorosamente ciascuna provetta contro il tappo per circa 40 secondi, quindi lasciare raffreddare a temperatura ambiente per 1 ora, agitando ciascuna provetta contro il tappo a intervalli di 10-12 minuti durante questo periodo. Preparare i bianchi enzimatici come segue: riscaldare, in provette separate, 10,0 mL di soluzione substrato e circa 5 mL di preparazione del campione a bagnomaria per 30 minuti, quindi aggiungere 10,0 mL di soluzione di acido tricloroacetico alla soluzione substrato, agitare bene per 40 secondi e a questa miscela aggiungere 2,0 mL della preparazione del campione preriscaldata. Agitare di nuovo e raffreddare a temperatura ambiente per 1 ora, agitando a intervalli di 10-12 minuti.
Al termine di 1 ora, agitare vigorosamente ciascuna provetta e filtrare su carta da filtro Whatman n. 42 o equivalente da 11 cm, rifiltrando la prima metà del filtrato attraverso la stessa carta. Determinare l'assorbanza di ciascun filtrato in una cella di 1 cm, a 275 nm, con uno spettrofotometro adatto, utilizzando il filtrato dal bianco del substrato per azzerare lo strumento. Correggere ciascuna lettura sottraendo la lettura del bianco enzimatico appropriato e registrare il valore così ottenuto come AU.
[Nota: se non si ottiene una lettura di assorbanza corretta tra 0,2 e 0,5, ripetere il test utilizzando più o meno la preparazione enzimatica secondo necessità.]

Trasferimento con curva standard 100,0 mg di L-tirosina, grado cromatografico o equivalente (Aldrich Chemical Co.), precedentemente essiccato a peso costante, in un matraccio volumetrico da 1000 mL. Sciogliere in 60 mL di acido cloridrico 0,1 N. Quando l'L-tirosene è completamente sciolto, diluire la soluzione a volume con acqua e mescolare accuratamente. Questa soluzione contiene 100 µg di tirosina in 1,0 mL. Preparare altre tre diluizioni da questa soluzione madre per contenere 75,0, 50,0 e 25,0 µg di tirosina per mL. Determinare l'assorbanza delle quattro soluzioni a 275 nm in una cella di 1 cm su uno spettrofotometro adatto contro 0,006 N di acido cloridrico. Preparare un grafico di assorbanza rispetto alla concentrazione di tirosina. Determinare la pendenza della curva in termini di assorbanza per µg di tirosina. Moltiplica questo valore per 1,10 e registralo come AS. Si dovrebbe ottenere un valore di circa 0,0084.


Calcolo della proteasi acida
Una unità HUT di proteolitica (proteasi acida) è definita come quella quantità di enzima che produce, in 1 min nelle condizioni specificate, un idrolizzato la cui assorbanza a 275 nm è uguale a quella di una soluzione contenente 1,10 µg / mL di tirosina in acido cloridrico 0,006 N.
Calcola la CAPANNA per g della preparazione enzimatica originale con l'equazione

CAPANNA / g = (AU / AS) × (22 / 30W)

in cui 22 è il volume finale della soluzione in esame; 30 è il tempo di reazione, in min; e W è il peso, in g, del campione originale prelevato.

[Nota: il valore per AS, in condizioni attentamente controllate e standardizzate, è 0,0084; questo valore può essere utilizzato per il lavoro di routine al posto del valore ottenuto dalla curva standard, ma il valore esatto calcolato dalla curva standard dovrebbe essere utilizzato per risultati più accurati e in caso di dubbio.]


CERTIFICATO DI ANALISI


nome del prodotto Proteasi acida    
Altro nome N / A Paese d'origine Cina
Sforzo Aspergillus oryzae Data di produzione 13 maggio 2019
Numero di lotto SP19050903 Data di scadenza 12 MAGGIO 2021
Pacchetto 25 kg / secchio Quantità 100 kg
PROTOCOLLO SPECIFICHE RISULTATI METODO
ANALISI FISICA E CHIMICA
Descrizione polvere marrone Conforme Visivo
Odore e sapore Odore e sapore caratteristici Conforme Gusto
Umidità NMT 7% 5.1% Analizzatore di umidità
IDENTIFICAZIONE
Attività identificabile Positivo per l'attività della bromelina Conforme In casa
ATTIVITÀ
Attività proteasica NLT 500.000 CAPANNA / g 508.270 CAPANNA / g FCC VII
MICROBIOLOGICO
Conta batterica totale
Batteri coliformi (CFU / g)
Muffe e lieviti
E.Coli
Salmonella
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa
NMT 3.000 CFU / g
NMT 30 CFU / g
NMT 100 CFU / g
Assente
Assente
Assente
Assente
500 CFU / g
<10 CFU / g
<10 CFU / g
Non rilevati
Non rilevati
Non rilevati
Non rilevati
FDA BAM Online Ch.3
FDA BAM Online Ch.4
FDA BAM Online Ch. 2
FDA BAM Online Ch.4
FDA BAM Online Ch.5
FDA BAM Online Ch.12
AOAC
METALLI PESANTI
Piombo
Mercurio
Cadmio
Arsenico
NMT 3 ppm
NMT 0,1 ppm
NMT 1 ppm
NMT 1 ppm
0,21 ppm
<0,1 ppm
<1 ppm
<1ppm
USP <231>
USP <231>
USP <231>
USP <231>
Conservazione: conservare in luogo fresco e asciutto al riparo dalla luce, tenere il fusto chiuso quando non in uso.
Conclusione: conforme agli standard IU.
Periodo di validità: Il periodo di validità della proteasi acida nelle condizioni di conservazione prescritte e nell'imballaggio a tenuta d'aria sarà di 2 anni.
Il prodotto è CONFORME alle suddette specifiche
Approvato dal firmatario autorizzato RICKY H. ZHU
*The above information is a direct translation of the information provided to Newgen Biotech from the manufacturer of proteasi acida. This Certificate of Analysis should be used for informational purposes and is not intended as a substitute for strict quality control analysis by the purchaser of this product.

Confezionamento e conservazione

Busta da imballaggio per alimenti solidi, 25 kg / barile.


La proteasi acida deve essere conservata in luoghi asciutti, freschi e ben ventilati, lontano dal sole, dal calore.

Pagamento:T / T, Paypal, Western Union, Alibaba Trade Assurance, VISA, MasterCard, e-Checking, Pay Later, LC e così via.

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